神經(jīng)干細胞-祖細胞 (NSPC) 是多能、自我更新的細胞，可產(chǎn)生放射狀膠質(zhì)細胞 (RGC)。RGC 隨后在神經(jīng)發(fā)育過程中產(chǎn)生神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。在這里，我們描述了 NSPC 分離和培養(yǎng)以形成稱為神經(jīng)球的克隆聚集體的過程。本章概述了多種檢測方法，使我們能夠量化這些細胞的增殖、自我更新潛力和分化的差異[1]。

神經(jīng)干細胞培養(yǎng)權(quán)威指南：NSPC高效提取與分化技術(shù)解析

1簡介

在干細胞和祖細胞研究領(lǐng)域，了解控制神經(jīng)生物學的復(fù)雜過程對于理解大腦內(nèi)的功能通路至關(guān)重要。干細胞和祖細胞具有分化成神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)各種細胞類型的非凡能力，這使得它們對于研究神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)退行性疾病或創(chuàng)傷相關(guān)損傷的潛在治療應(yīng)用具有無價的價值。然而，理解控制其行為的潛在機制需要可靠且多功能的實驗技術(shù)。

近年來，神經(jīng)球測定法就是一項獲得廣泛認可的技術(shù)。該測定法最初 1992年開發(fā)，現(xiàn)已成為神經(jīng)干細胞研究的基石。該測定法能夠從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域（包括胚胎、胎兒和成人階段）分離、擴增和表征神經(jīng)干細胞。此外，該測定法還能檢查干細胞和祖細胞對各種基因和藥理操作的反應(yīng)，為神經(jīng)發(fā)育過程、神經(jīng)再生和疾病建模提供有價值的見解。這些神經(jīng)球由一群異質(zhì)性細胞組成，其中包括神經(jīng)干細胞和祖細胞，它們能夠分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細胞類型，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。通過利用特定的生長因子和培養(yǎng)條件，研究人員可以有效地維持干細胞和祖細胞的自我更新能力，促進其增殖并防止自發(fā)分化。

這項檢測為研究干細胞和祖細胞神經(jīng)生物學提供了許多優(yōu)勢。

首先，神經(jīng)球檢測可以大量擴增神經(jīng)干細胞和祖細胞，同時保留其多能性。

其次，神經(jīng)球檢測提供了一種三維 (3D) 培養(yǎng)系統(tǒng)，更接近于體內(nèi)微環(huán)境。神經(jīng)球的3D特性為干細胞和祖細胞提供了支持性的“體外環(huán)境”，模擬了神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞相互作用和空間組織。

第三，神經(jīng)球檢測可以檢查干細胞和祖細胞對各種因素和刺激的反應(yīng)。通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的成分，研究人員可以研究生長因子、小分子和其他生物線索對干細胞行為的影響。此外，該檢測法還允許引入基因操作，例如基因過表達、缺失或敲低，以剖析干細胞和祖細胞神經(jīng)生物學中涉及的分子通路。神經(jīng)球檢測法還提供了藥物篩選和毒性測試的機會，有助于開發(fā)新的治療策略。

最后，這些 NSPC 的分化能力也可以在體外建模，從而確定提取的細胞中特定的祖細胞群是否可能受到損害。

總之，神經(jīng)球試驗已成為了解干細胞和祖細胞神經(jīng)生物學的寶貴工具。它能夠擴增和維持多能細胞，具有3D培養(yǎng)環(huán)境，并且能夠靈活地研究各種因素和疾病，使其成為揭示控制神經(jīng)發(fā)育、再生和疾病進展的復(fù)雜機制的理想系統(tǒng)。

2材料

2.1 NSPC 分離和培養(yǎng)

• 1.磷酸鹽緩沖液 (PBS)：配置10×溶液，將80gNaCl、2 g KCl、14.4 g Na?₂?HPO?₄加至 800 mL 蒸餾水。調(diào)節(jié) pH 至 7.4 并加至 1 L。對于 1× PBS，將 100 mL 10× PBS 加至 900 mL 蒸餾水。
• 2.漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）。
• 3.神經(jīng)球基礎(chǔ)培養(yǎng)基（NSBM；1:1 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基 [DMEM] 和 F12、4 μg/mL 肝素、100 μg/mL 青霉素/鏈霉素）。
• 4.堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)。
• 5.表皮生長因子（EGF）。
• 6.B27（不含維生素A）。
• 7.低粘附性 6 孔組織培養(yǎng)板。
• 8.神經(jīng)球解離溶液（50 mL HBSS、0.01 g EDTA、0.0125 g 胰蛋白酶 [0.25 mg/mL]、0.119 g N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸 [HEPES]，pH 值 8；以 1 mL 分裝在 ?20 °C 下冷凍，使用前立即解凍）。
• 9.中和溶液（50 mL HEPES 緩沖 DMEM、0.007 g 大豆胰蛋白酶抑制劑 [0.14 mg/mL]，以 1 mL 分裝在 ?20 °C 下冷凍，使用前立即解凍）。
• 10.60 孔 Terasaki 細胞培養(yǎng)板。
• 11.二甲基亞砜（DMSO）。

2.2神經(jīng)球分化

• 1.8孔腔室載玻片。
• 2.聚-D-賴氨酸和層粘蛋白。
• 3.胎牛血清（FCS）。
• 4.4% 多聚甲醛 (PFA)：將 4 克 PFA 與約 70 毫升去離子無菌水混合。在 60 °C 下?lián)u動溶解。溶解后，過濾 PFA，并用無菌去離子水加滿至最終體積 100 毫升。
• 5.用于識別神經(jīng)元 (小鼠抗 Tuj1) 和星形膠質(zhì)細胞 (兔抗 GFAP) 的一抗。
• 6.二抗山羊抗鼠 555 和山羊抗兔 488。
• 7.4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)。
• 8.水性封固劑。

2.3逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導

• 1.0.5 M氯化鈣。
• 2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)導逆轉(zhuǎn)錄病毒gag和pol基因的人類胚胎腎 (HEK) 細胞 (HEK-293gp；病毒包裝細胞系)。
• 3.含有 5% FCS 和100μg/mL青霉素/鏈霉素的 DMEM（DMEM/FCS/PS）。
• 4.60cm2個組織培養(yǎng)板。
• 5.DMEM補充有5-10%FCS和100μg/mL 青霉素/鏈霉素。
• 6.2× HEPES 緩沖鹽水，pH 值 7.0 (HeBS)。
• 7.包含目的蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（例如MSCV）。
• 8.水泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）包膜質(zhì)粒。
• 9.5 mL 注射器和0.45μm注射器過濾器。
• 10.超速離心機和10mL超速離心管。
• 11._^水中重組纖連蛋白 (rFN)濃度為1mg/mL。
• 12.補充有2%牛血清白蛋白 (BSA) 的PBS。
• 13.24孔組織培養(yǎng)板。

3方法

3.1胚胎NSPC分離

• 1.在E14.5時對懷孕的母鼠實施安樂死，從子宮中收集胚胎，并立即放入含有冷 PBS 的培養(yǎng)皿中。
• 2.一次一個地去除胚胎的絨毛膜并除去胎盤（見注釋1）。
• 3.解剖胚胎的頭部，并在解剖顯微鏡下輕輕地將頭骨從大腦中切掉。
• 4.接下來，沿矢狀切開大腦，將其分成左、右半球。
• 5.去除每個半球的外部皮質(zhì)，留下內(nèi)側(cè)、尾部和外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（見注釋2）。
• 6.一旦解剖，將神經(jīng)節(jié)隆起放入含有5mL新鮮HBSS的15mLFalcon管中，放在冰上，直到所有大腦都被解剖（圖1）。
• 7.在層流罩中，用移液器輕輕研磨以分解組織。
• 8.將分解的組織以1200×g的速度離心5分鐘。
• 9.去除上清液并將細胞重新懸浮在5mL NSBM中，補充10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20ng/mL 表皮生長因子和 1:50 B27（不含維生素 A）。
• 10.將細胞轉(zhuǎn)移到低粘附性6孔板中，使細胞形成克隆聚集體（神經(jīng)球）。
• 11.在37 °C和5%CO₂條件下孵育細胞。

胚胎采集后，將腦從顱骨中取出 (?a?)。接下來，去除皮質(zhì)層，只留下外側(cè)、內(nèi)側(cè)和尾部神經(jīng)節(jié)隆起（分別為 LGE、MGE 和 CGE；b）。然后用移液器輕輕打碎，留下單細胞懸浮液 (?c?)。培養(yǎng)后，GE 中的神經(jīng)干細胞/祖細胞 (NSPC) 形成克隆聚集體，稱為神經(jīng)球 (?d?)。這些可以分離（“傳代”）成進一步的單細胞懸浮液 (?e?) 并重新接種，在那里它們將再次重新形成神經(jīng)球 (?f?)

3.2 NSPC文化

• 1.每2天取出2.5mL（一半體積）培養(yǎng)基（注意避免丟棄神經(jīng)球；參見?注釋 3）。
• 2.加入2.5mL新鮮NSBM，其中含有1:50不含維生素A的B27以及兩倍濃度的 EGF 和 bFGF（20 ng/mL βFGF、40 ng mL EGF；稱為 NSBM+2×GFs）。這將確保 GFs 的最終濃度保持在 1×。

3.3神經(jīng)球解離和傳代

• 1.維持培養(yǎng)直至大多數(shù)神經(jīng)球變大，中心呈深色（約5-7天生長；圖2）。培養(yǎng)基將開始變成橙色/黃色。
• 2.為了傳代，將細胞轉(zhuǎn)移到15mL Falcon 管中，并以700×g離心7分鐘。
• 3.除去上清液并在室溫下將神經(jīng)球輕輕懸浮在 500 μL 解離溶液中3分鐘，并輕輕研磨。
• 4.在室溫下用500 μL中和溶液中和解離溶液3分鐘，并輕輕研磨。
• 5.接下來，通過添加 8 mL NSBM 來清洗分離的細胞，然后在1300×g下離心5分鐘?。
• 6.去除上清液并將細胞重新懸浮在 1 mL NSBM 中，進行細胞計數(shù)。
• 7.取所需數(shù)量的細胞（取決于所進行的分析；見下文）并加入5mLNSBM+1×GF。對于常規(guī)傳代，細胞應(yīng)以1–5 ×10⁵個細胞/毫升的密度接種。
• 8.將新傳代的細胞放入6孔低粘附組織培養(yǎng)板的新鮮孔中，并在 37°C和5%CO₂下孵育。

正常神經(jīng)球生長為自由漂浮的球體 (?a?)；健康、活的神經(jīng)球?qū)⒊尸F(xiàn)為中心呈深色的實心球 (?b?)，而大多數(shù)細胞已發(fā)生凋亡或壞死的神經(jīng)球?qū)⒊尸F(xiàn)松散和蒼白 (?c?)?？蓪⒔】瞪窠?jīng)球分離并以 5 個細胞/10 μL 的密度接種于 Terasaki 板中（每板 60 個孔）。接種后（2 小時）立即存在的活細胞數(shù)量可進行定量分析 — 大多數(shù)孔中將有 0 個或 1 個細胞（綠點；d）。培養(yǎng) 24 小時后，很少細胞會開始分裂，但有些細胞將發(fā)生凋亡（紅色 x）。到 7 天時，任何具有自我更新潛力的細胞都將產(chǎn)生包含 >4 個細胞的神經(jīng)球，而無潛力的細胞將發(fā)生凋亡。當在正常粘附板上生長時，神經(jīng)球會粘附、長出突起（箭頭），并開始分化（e）。然后可以使用免疫組織化學（f）檢測，以可視化 Tuj1⁺神經(jīng)元（紅色）和 GFAP?⁺星形膠質(zhì)細胞（綠色）占所有細胞的比例（藍色細胞核；DAPI）

3.4累積細胞數(shù)測定

• 1.按照3.2節(jié)步驟2的步驟分離神經(jīng)球后，計數(shù)細胞并以1-5×10⁵細胞/mL的濃度接種于 NSBM + 1 × GF 的低粘附性6孔板上。
• 2.每 2-3 天，移除培養(yǎng)基并更換為新鮮的 NSBM + 2 × GF。這將確保細胞繼續(xù)在 NSBM + 1 × GF 中生長。
• 3.每7天，按照第3.2節(jié)步驟2進行細胞傳代，并記錄每周計數(shù)。根據(jù)神經(jīng)球的健康狀況，應(yīng)重復(fù)此操作 5-6 周。

3.5神經(jīng)球存活率測定

• 1.在 NSBM +1 × GF 的低粘附性 6 孔板上，每孔接種約 20-50 個第 7 天神經(jīng)球。
• 2.計算存在的神經(jīng)球的確切數(shù)量。
• 3.將神經(jīng)球放置 14 天，不要更換培養(yǎng)基或重新添加生長因子。
• 4.計算由仍然存活的細胞組成的神經(jīng)球的確切數(shù)量（圖2）。

3.6克隆密度測定法測量不依賴于“體外微環(huán)境”的神經(jīng)球形成

• 1.按照3.2節(jié)步驟2分離神經(jīng)球，并對分離的細胞進行細胞計數(shù)。
• 2.將 1-2 × 10?^{4 個}細胞放入 NSBM + 1 × GF 的低粘附性6孔板中，每孔培養(yǎng)。
• 3.每 2 天，取出培養(yǎng)基并用新鮮的 NSBM + 2 × GF 替換。這將確保細胞繼續(xù)在 NSBM + 1 × GF 中生長。
• 4.第 7 天，計算已形成的神經(jīng)球的數(shù)量。

3.7單細胞分析確定神經(jīng)球形成潛力

• 1.按照3.2節(jié)步驟2分離神經(jīng)球，并對分離的細胞進行細胞計數(shù)。
• 2.將細胞以 500 個細胞/mL 的濃度重懸于 NSMB + 1 × GF 中。
• 3.將 10 μL 細胞懸浮液分裝到 60 孔 Terasaki 板的每個孔中。
• 4.統(tǒng)計 2 小時后每個孔中的細胞數(shù)。每個孔中應(yīng)該有 0 或 1 個細胞；在極少數(shù)情況下，可能會看到 2 個細胞。
• 5.統(tǒng)計 24 小時和 48 小時時存在的細胞數(shù)量；一些 NSPC 可能已開始分裂。
• 6.在 48 小時時，向仍含有至少 1 個活細胞的孔中添加 10 μL NSBM + 2 × GF。
• 7.對已形成由≥4個細胞組成的神經(jīng)球的孔數(shù)進行評分。

3.8分化試驗定量神經(jīng)源性潛能

• 1.準備8孔腔室載玻片，每個孔涂上150μL聚-D-賴氨酸 + 20 μg/mL 層粘連蛋白。這將確保 NSPC 能夠粘附。
• 2.在室溫下孵育 1 小時。
• 3.去除聚-D-賴氨酸+層粘連蛋白并用 PBS 清洗 2 × 5 分鐘。
• 4.按照3.2小節(jié)步驟2解離 7 天培養(yǎng)的神經(jīng)球，并對解離的細胞進行細胞計數(shù)。
• 5.以700×g的速度離心細胞7 分鐘。
• 6.將細胞懸浮在補充有 1% 胎牛血清的500μL NSBM + 1 × GF 中。
• 7.將1×10⁵個細胞/孔放入 8 孔板中。
• 8.每 2 天取出培養(yǎng)基并替換為新鮮的 NSBM + 1 × GF + 1% FCS。
• 9.7 天后，在室溫下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定細胞 30 分鐘。
• 10.接下來，用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 對細胞進行通透 10 分鐘。
• 11.通過在 PBS 中的 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 中孵育細胞 30 分鐘來進行阻斷。
• 12.與鼠抗 Tuj1（在封閉溶液中稀釋至 1:1000）（每孔 100 μL）一起在 4 °C 下孵育過夜。
• 13.用 PBS 清洗載玻片 2 次，每次 2 分鐘，然后在室溫下與山羊抗鼠 555 二抗孵育 30 分鐘，在封閉溶液中稀釋至 1:1000（每孔 100 μL）。
• 14.用 PBS 清洗載玻片 2 × 3 分鐘，然后用 PBS 中的 4% 多聚甲醛在室溫下固定 10 分鐘。
• 15.用 PBS 清洗載玻片 2 × 3 分鐘，并與兔抗 GFAP（在封閉溶液中稀釋至 1:500；每孔 100 μL）在 4 °C 下孵育過夜。
• 16.用 PBS 清洗載玻片 2 次，每次 2 分鐘，然后與山羊抗兔 488 二抗（每孔 100 μL）一起在室溫下孵育 30 分鐘，在封閉溶液中稀釋至 1:1000。
• 17.先用 PBS 清洗載玻片 3 次，每次 2 分鐘，然后在室溫下用 PBS 稀釋的 DAPI 孵育 5 分鐘。
• 18.使用提供的腔室拆卸工具小心地取出介質(zhì)腔室，然后使用剃須刀片或美工刀刮掉膠水。
• 19.然后將載玻片安裝在水性封固劑中，并放置干燥過夜，然后進行成像（圖2）。

3.9冷凍神經(jīng)球

• 1.培養(yǎng)神經(jīng)球直至其達到一定的尺寸和密度，表明它們已準備好通過。
• 2.從培養(yǎng)容器（例如燒瓶、培養(yǎng)板）中取出神經(jīng)球，以 700 ×??g的速度離心7 分鐘。
• 3.除去上清液并將細胞輕輕地重新懸浮在 500 μL NSBM + 2 × GF 中，其中含有 B27 的濃度為 1:25 而不是 1:50。
• 4.將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到冷凍管中并置于冰上。將 500 μL 20% DMSO（溶于 DMEM）加入冷凍管中并輕輕混勻。
• 5.冷凍管應(yīng)立即放入冷凍保存容器中，以確保緩慢冷凍。冷凍后，應(yīng)將樣本放入液氮中保存。

3.10解凍神經(jīng)球

• 1.將 NSBM + 1 × GF（每個樣品 5 毫升）預(yù)熱至 37 °C。
• 2.從液氮儲存中取出冷凍管并置于 37°C 下快速解凍。
• 3.立即將解凍的神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的培養(yǎng)基中，并以 700 ×g的速度離心7 分鐘。
• 4.除去上清液并將神經(jīng)球輕輕懸浮在 5 mL 新鮮 NSBM + 1 × GF 中。

3.11逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導

• 1.將HEK-293gp細胞放入60cm?²培養(yǎng)板中的DMEM/FCS/PS中，培養(yǎng)直至匯合率達到約90％。
• 2.將 500 μL 2 × HEPES 緩沖鹽水（pH 7.0）（HeBS）加入到 10 mL 聚丙烯管中。
• 3.將 10 μg 質(zhì)粒/板與 10 μg/板水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSVG) 包膜質(zhì)粒和 0.5 M CaCl?₂相結(jié)合，最終體積為 250 μL，用無菌 H?₂?O溶解。
• 4.將質(zhì)粒/VSVG 混合物逐滴添加到 HeBS 中，同時使空氣通過 HeBS 起泡（例如，使用移液器或類似設(shè)備）。
• 5.將反應(yīng)混合物在室溫下孵育 20 分鐘。
• 6.逐滴加入HEK-293gp細胞中并在37°C、5%CO 2下孵育24小時。
• 7.取出培養(yǎng)基并替換為 10 mL NSBM。
• 8.將細胞在 37 °C、5% CO 2條件下孵育 72 小時。
• 9.從孔中取出細胞并以 1400 ×g的速度離心5 分鐘。
• 10.通過 0.45 μm 注射器過濾器過濾上清液以去除細胞碎片。
• 11.將上清液放入超速離心機，以 25,000×g的速度離心 90 分鐘，以濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒。
• 12.取出 9.5 mL 上清液，輕輕將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒懸浮于 1 mL 新鮮 NSBM 中。病毒可以 500 μL 等分試樣形式儲存于 ?70 °C。
• 13.將 19 μg rFN 涂在 200 μL PBS 中的 24 孔組織培養(yǎng)板中的單個孔中，在 4 °C 下至少放置 16 小時。
• 14.在室溫下用 400 μL PBS + 2% BSA 清洗每個孔 30 分鐘。
• 15.在室溫下用 2 mL PBS 清洗 2 次。
• 16.向每個孔中添加 500 μL 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，并在 32°C 下以 1500× g的速度離心?60 分鐘，以促進逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與 rFN 結(jié)合。
• 17.按照3.2小節(jié)步驟2解離神經(jīng)球，去除病毒上清液，并將 5×10⁵個NSPC（含 NSBM + 1 × GF）接種到每個孔中（見?注釋 4）。
• 18.培養(yǎng)24h，除去NSBM，加入500μL神經(jīng)球中和液。
• 19.孵育 3 分鐘，用移液器輕輕研磨細胞，并轉(zhuǎn)移到 15 mL 管中。
• 20.以1300 ×g的速度離心5 分鐘。
• 21.除去上清液，將細胞懸浮在 2 mL NSBM + 1 × GF 中，并轉(zhuǎn)移至超低附著6孔板（見注釋5）。
• 22.按照小標題3.2所述培養(yǎng)神經(jīng)球。
• 23.如果逆轉(zhuǎn)錄病毒含有熒光標記，則使用熒光顯微鏡觀察成功感染的神經(jīng)球（圖3）。

神經(jīng)球（此處顯示為 20 倍和 40 倍）生長 7 天，分解，生長為單層，感染逆轉(zhuǎn)錄病毒，并重新形成神經(jīng)球。在明場光學系統(tǒng)（a、b）和藍光（c、d）下檢查這些神經(jīng)球，以識別 GFP+ 神經(jīng)球。還顯示了合并的照片（e、f）

4注

1.將每個胚胎放在單獨的培養(yǎng)皿中解剖。如果需要對胚胎進行基因分型，則取出一小塊肢體組織、剩余的大腦或卵黃囊，以便隨后提取 DNA 并進行基因分型。

2.神經(jīng)節(jié)隆起 (GE) 很容易被識別，因為它們在明視野顯微鏡下看起來比上面的皮質(zhì)層更暗。

3.為了避免在更換一半培養(yǎng)基時丟失神經(jīng)球，請輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)板以收集每個孔中心的神經(jīng)球（特別是對于>7 天的神經(jīng)球）。然后可以從邊緣去除培養(yǎng)基，以確保神經(jīng)球損失最小。

4.將神經(jīng)球接種到這些培養(yǎng)皿中，可使神經(jīng)干細胞以單層培養(yǎng)物（而不是漂浮的神經(jīng)球）的形式生長，而不會誘導分化。單層培養(yǎng)將大大提高該技術(shù)中逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率。

5.使用含有熒光報告基因的質(zhì)粒非常有益，因為可以使用熒光激活細胞分選 (FACS) 分析確定陽性細胞和感染效率。

參考資料：Gasperoni, J., Dworkin, S. (2024). Neural Stem/Progenitor Cell (NSPC) Extraction and Culture. In: Dworkin, S. (eds) Neurobiology. Methods in Molecular Biology, vol 2746. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3585-8_9

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